EvaRuby™ 是第一种用于 qPCR 和 HRM 的可见红色 DNA 结合染料。该染料具有独特的光谱特性，可最大限度地减少通道之间的串扰。EvaRuby™ 可用作 qPCR、HRM® 和 LAMP 的典型嵌入染料。该染料还可以结合到基于探针的 qPCR 分析中，以实时监测反应并进行 qPCR 后的高分辨率熔解分析。

• 用于 qPCR 的可见红色 DNA 嵌入染料

• 在同一反应中结合基于探针的 qPCR 与 HRM®

• 独特的光谱特性，可将其他通道中的串扰降至最低

• 用作内部对照，实时监测基于探针的 qPCR 反应

• 避免在 qPCR 后凝胶电泳上浪费时间和资源

• Ex/Em 480/613 nm（含 DNA）；使用 ~488 nm 激发和 ~610 nm 发射滤光片进行检测

EvaRuby™ 染料的独特性能

EvaRuby™ 是一种为 qPCR 设计的可见红色荧光核酸染料，因此它本身基本上不发荧光，但在与 dsDNA 结合后会发出荧光。与 EvaGreen® 或 SYBR® 嵌入 qPCR 染料不同，EvaRuby™ 具有长斯托克斯位移和橙色荧光发射。EvaRuby™ Dye 的激发/发射峰位于 480/613 nm，使用与 EvaGreen® 相同的绿色/蓝色通道进行激发，但在橙色（JUN™ 或 ROX）通道中检测到。因此，EvaRuby™ 在其他检测通道中的串扰最小，因此可以整合到基于单重和多重探针的 qPCR 测定中（图 1）。

图 1. 1X EvaRuby™ Dye 对 CAL Fluor® Red 610 水解探针在 10 倍稀释的人 gDNA 中扩增和检测 TFCR 基因的影响。EvaRuby™ 和 CAL Fluor® Red 610 探针共享 610 nm 发射通道。然而，由于用于探针的 Qiagen Rotor-Gene® Q Orange (585 nm) 激发通道对 EvaRuby™ 的激发最小，因此由探针生成的标准曲线几乎不会因 EvaRuby™ 的存在而改变。

虽然 EvaRuby™ 可用作传统的嵌入 qPCR 染料来执行实时 qPCR、熔解曲线分析、LAMP 和 HRM®，但该染料的主要优势在于它可以结合到基于探针的 qPCR 测定中。与其他嵌入染料不同，EvaRuby™ 独特的光谱特性使其能够与常用的荧光 qPCR 探针结合，在其他荧光通道中几乎没有串扰。染料可以在反应设置期间添加到反应混合物中，而不影响探针特异性（图 1、2），同时扩展基于探针的 qPCR 的功能，包括实时故障排除和 qPCR 后高分辨率熔解分析（图 3） . 请注意，对于传统的基于单色染料的 qPCR，我们仍然建议使用 EvaGreen® Dye。

图 2. EvaRuby™ 对水解探针测定 Ct 的影响。使用常见的基于探针的 qPCR 设置对每种探针染料进行了三个独立的 qPCR 测定。每个点都是由指示探头确定的 Ct 值。尽管在激发或发射光谱中有一些重叠，但在没有 EvaRuby™（环）的标准基于探针的测定中，探针获得的 Ct 值与探针与 EvaRuby™（圆圈）组合使用时获得的 Ct 值差别很小.

图 3. 高分辨率熔体数据差异图。Forget-Me-Not™ Universal Probe qPCR Master Mix（货号 31043）中的 1X EvaRuby™ Dye 用于检测 Applied Biosystems® MeltDoctor™ HRM 阳性对照试剂盒。使用 Qiagen® Rotor-Gene® Q，0.1°C/2 秒，470 nm 激发和 610 nm 发射滤光片采集数据。使用基线减法使用 uAnalyzeSM (https://dna-utah.org) 进行数据分析。EvaRuby™ Dye 可以清楚地区分每个纯合变体以及杂合变体。

基于探针的 qPCR 的新内部控制

基于染料的 qPCR 具有较低的靶特异性，但具有通过熔解曲线分析快速、轻松地确认结果的优势。另一方面，基于探针的 qPCR 受益于高靶特异性，但与熔解曲线分析不兼容。相反，qPCR 结果的确认通常通过凝胶电泳来完成，这是一个劳动密集型的步骤，会增加获得结果的时间。将 EvaRuby™ 与基于探针的 qPCR 结合使用可以实现高靶标特异性的探针以及用于熔解分析和结果确认的嵌入染料。此外，由于 EvaRuby™ 信号独立于探针信号，因此它可作为 PCR 扩增的内部对照。例如，尽管放大成功，降解或次优的探针可能无法与扩增的靶序列结合，因此 qPCR 会错误地报告扩增失败。然而，在存在 EvaRuby™ 的情况下，仍可在 qPCR 期间检测到扩增，并可通过熔解曲线分析进行鉴定。

仪器兼容性

EvaRuby™ 需要使用定制的 qPCR 检测通道进行检测。您的 qPCR 仪器必须具有 ~470 nm 激发和 ~610 nm 发射滤光片，以及使用这种非标准滤光片组合采集数据的选项。带有成对激发/发射滤光片的仪器可能与染料不兼容。EvaRuby™ 已在 Applied Biosystems® QuantStudio™ 5 96 孔和 Qiagen® Rotor-Gene® Q 仪器上得到验证。PI 中提供了其他仪器的兼容性表；但是，在购买 EvaRuby™ Dye 之前，通过检查您的仪器技术规格或联系仪器制造商来确认兼容性非常重要。

如果您的 qPCR 仪器需要被动参考染料，请使用VeriFluor™ Far-Red（货号 29087）以获得最佳结果。在红色（Cy®5 或 Mustang Purple™）荧光通道中检测到 VeriFluor™ Far-Red。高 ROX 浓度 (~500 nM) 与 EvaRuby™ 不兼容。使用低 ROX 浓度 (~50 nM) 进行标准化不是最理想的，并且会导致 EvaRuby™ 通道中的背景荧光略有增加。

 EvaGreen Dye 和应用程序涵盖在已授予和正在申请的美国和国际专利中。Rotor-Gene 是 Qiagen 的注册商标。QuantStudio、JUN 和 Mustang Purple 是 Thermo Fisher Scientific 的商标或注册商标。Cy Dye 是 GE Healthcare 的注册商标。CAL Fluor 是 Biosearch Technologies, Inc. 的注册商标。HRM 是 Idaho Technologies, Inc./BioFire Defense, LLC 的注册商标，其使用可能需要获得许可。