线粒体染料，包括MitoView™ 线粒体染料，带正电且亲脂。由于线粒体中的质子梯度，它们被动地扩散穿过细胞膜并被推测在线粒体基质中积累（有关详细审查，请参见Cytometry Part A79A: 405-425, 2011）。

然而，一些染料在去极化后仍保留在线粒体中。我们的染料化学家假设这是因为一些染料比其他染料更亲脂。一旦它们由于带电而聚集在线粒体中，由于它们的疏水性，它们就不太可能扩散回细胞质，即使在吸引它们的质子梯度被线粒体去极化消散之后也是如此。可能它们与线粒体膜有关。

所谓的电位独立染料，如MitoView™ Green、MitoTracker® Green 和壬基吖啶橙，比电位响应染料（如MitoView™ 633、罗丹明 123和JC-1）疏水性强得多。线粒体去极化后保留前一种染料，可用于测量独立于电位的线粒体质量。然而，将这些染料称为相对电位不敏感而不是电位独立会更准确，因为线粒体电位仍然在它们的定位中发挥作用。据报道，这些染料在去极化时显示出一些信号损失（Cytometry 39(3):203-10, 2000）。

还有一类线粒体染料根据电荷聚集在线粒体中，但也有一个反应基团，可以将染料共价连接到线粒体内的蛋白质靶标上，使它们在固定和透化后能够很好地保留。我们的MitoView™ Fix 640  就是这种类型的染料。

一些染料，如MitoView™ Green可以染色已经固定的细胞中的线粒体。发生这种情况的机制尚不清楚。固定后，线粒体中应该没有质子梯度来吸引染料。我们的化学家怀疑固定线粒体中可能存在一些残余膜电位，这不是由于质子梯度（固定后会消失），而是由于具有不同等电点（净电荷）的蛋白质分布不均匀。有报道称，细胞器中常驻蛋白的净电荷因细胞室的 pH 值而异（Proc Natl Acad Sci USA 115(46):11778-11783, 2018). Charge differences may be sufficient to attract cationic lipophilic dyes to mitochondria in the absence of a proton gradient, due to a combination of weak electrostatic and hydrophobic interactions with mitochondrial proteins and membranes.

However, currently there is no direct evidence to suggest this is the mechanism for MitoView™ Green staining of fixed cells. There may be other targets that the dye is binding. For example, Nonyl Acridine Orange is reported to bind cardiolipin, a lipid that is enriched in mitochondrial membranes. It’s possible that MitoView™ Green binds to particular molecules in mitochondria with some degree of specificity. However, staining of fixed cells with mitochondrial dyes generally is not as specific as staining of live cells. That’s why we recommend using mitochondrial marker antibodies instead of dyes to stain fixed cells when possible.