1）反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；

2）引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

3）探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；

4）模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；

5）模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。