1）引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；

2）引物浓度不佳：适当调整引物浓度；

3）退火温度低：提高退火温度；

4）镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；

5）模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。